Женьшень «ин витро»



Новый, совершенно нетривиальный, как говорят исследователи, подход к решению проблемы получения женьшеня был подготовлен важными открытиями в области генетики, цитологии, физиологии, эмбриологии, химии органических соединений и других наук. Пожалуй, самой главной предпосылкой к его постановке послужили фундаментальные положения клеточной теории. М. Шлейдена и Т. Шванна.
Выращивание и благополучное сохранение культуры женьшеня «ин витро», в стекле, как говорят специалисты, само по себе было выдающимся достижением ученых физиологов. За один месяц масса размножившихся клеток достигла трех граммов. Чтобы набрать такой вес, корню женьшеня в культуре на грядках требуется не менее трех-четырех лет, а «дикарю» может не хватить и десяти. Таким образом, «ин витро» женьшеню несколько «природных» лет удалось сократить до одного месяца.
Бутенко была убеждена, что это далеко не предел. Чем же можно усилить темп роста каллуса корня? Перепробовали многое — каллусовые клетки «не отказывались». Не подкормить ли каллус женьшеня кокосовым молоком? Идея не столь сумасбродная, какой выглядит на первый взгляд. Запустили очередную серию экспериментов, добавили в питательную среду 10 процентов «молока» и с волнением ждали результатов. Отзовется или не отзовется? Масса клеток на молочной подкормке за месяц увеличилась до 5—6 граммов, почти вдвое больше, чем на стандартной питательной среде. Исследователи прикинули теоретически возможный выход продукции женьшеня за год жизни «ин витро» и ахнули. Когда о подсчете доложили шефу, она хладнокровно склонилась над выкладками. Затем удовлетворенно хмыкнула и широко улыбнулась. Так и должно было получиться, но дуть в трубы и бить в барабану не следует. Общая идея исследований в своей сути оказалась правильной и приобрела веские доказательства правоты. Это факт. Но помех на многоэтапном пути получения женьшеня «ин витро» предостаточно — это тоже факт. Будем работать дальше! И никакого шуму.
Самое главное и самое трудное — получить стерильный исходный материал. На какие только ухищрения не приходилось идти исследователям! Корень, лист или побег, от которого рассчитывали взять кусочек для запуска культуры, эту живую основу для экспериментов, дезинфицировали то хлорной известью, то перекисью водорода, то обдавали спиртом, то обжигали на огне. «Несмотря на все старания экспериментатора, 75 процентов и даже больше культур оказываются инфицированными», — с прямотой настоящего ученого во всеуслышание заявила Бутенко. Надо совершенствовать методику стерилизации!
В боксе — специальной комнате для изоляции и пересадки растительных тканей, в этой святая святых лаборатории — все подчинялось жесткому требованию «не занеси, не зарази». Тамбур с двумя герметическими дверями, отсутствие окон, ни отопительных, ни охлаждающих приборов и устройств. Смысл? Смысл в том, чтобы исключить малейшее движение воздуха внутри бокса, исключить доступ невидимых вирусов и микробов. В боксе горит яркий свет. Манипуляции выполняются сложные и тонкие, напрягать зрение — значит быстрее уставать, значит нервничать, делать лишние движения. Включены бактерицидные лампы, убивающие микробов, которых могут занести сами сотрудники, — вероятность этого не исключена полностью. Перед началом «операции» все предметы в боксе, решительно все протираются спиртом. Люди надевают стерильные халаты, косынки, обувь, повязывают марлевые маски. Руки моют в соответствии с самыми ужесточенными требованиями. Во время работы их периодически протирают спиртом. «Движение и разговоры в операционной комнате должны быть сведены к минимуму», — сурово требует инструкция, собственноручно составленная шефом.
Иногда получалось так, что новый каллус плохо приживался в среде, останавливался в росте. Бутенко нашла выход из этой, как вначале думалось, тупиковой ситуации. В колбу добавили немного клеток другого каллуса женьшеня, прошедшего не одну и не две пересадки, а поэтому «привыкшего» ко всем превратностям судьбы. Они размножались, как ни в чем не бывало. Пример клеток-«ветеранов» благотворно влиял на «молодежь», та начинала быстрее расти и размножаться. Такой остроумный прием получил название метода культуры «няньки» или «наставника».
Развитие новых направлений в науке идет куда интенсивнее, если основоположник сплачивает вокруг себя большой коллектив, создает школу своих прямых последователей, делает основную ставку на молодежь. Сотруднице Ленинградского химико-фармацевтического института Лидии Ивановне Слепян шеф поручила «оттачивание» методики выращивания культуры ткани корня женьшеня на плотной питательной среде. Но, пожалуй, самое важное, подчеркнула Раиса Георгиевна, это нужно хорошо выяснить фармакологическую и, следовательно, медицинскую ценность ткани корня «ин витро». Требуется сравнить ее свойства с природными «дикими» корнями. В связи с этим вырисовывается интересная диссертационная, а не диссертабельная тема.
Лидия Ивановна разве что не ночевала в лаборатории Бутенко. Удалось установить, что каллус женьшеня благополучно растет около сорока дней, но затем прирост резко уменьшается, поэтому часть клеток нужно пересаживать в другую колбу или пробирку со свежей питательной средой. Такая пересадка клеток или тканей на языке специалистов именуется пассажем. Что показал химический анализ? Слепян определила, что в изолированных растущих тканях число групп биологически активных веществ точно такое же, как у пяти-шестилетних природных корней. Словом, клетки «ин витро» не только формируют, но и выделяют активные вещества. У женьшеня, выращенного на грядках, лекарственных веществ образуется почему-то меньше, а «ин витро», выходит, не отличается от «дикаря».
Целебные свойства экстракта из каллуса Лидия Ивановна изучала на классическом объекте— на белых лабораторных мышах. Эффект действия определялся по длительности сохранения у зверьков двигательной активности. Методика эксперимента была разработана известным дальневосточным исследователем профессором И. И. Брехманом. В особых вертикальных камерах-пеналах, сделанных из прозрачного плексигласа, по центральной оси сверху вниз непрерывно движется канатик. Пол камеры устроен из металлической проволоки. Подопытные мыши, которым экспериментатор ввел дозу экстракта, запускаются в персональные камеры. Контрольные животные вместо экстракта получают плацебо, нейтральный раствор. Убедившись, что зверьки освоились в новой обстановке, исследователь включает систему, канатики начинают двигаться и одновременно через пол пропускается слабый электрический ток. Желая избавиться от неприятных ощущений, мышь проворно лезет вверх по беспрерывно спускающемуся вниз канатику. Ей приходится лихорадочно перебирать ногами, иначе она рискует оказаться на полу. Кто дольше сможет выполнить «бег на месте» — подопытные или контрольные зверьки? Контакт с полом заставляет мышей, уже утомившихся, вновь карабкаться по бесконечному канатику, и так до полного изнеможения. Строго отмечается время опыта. Серия экспериментов с семью партиями мышей, в каждой из которых участвовало по шестнадцать зверьков, позволила установить, что экстракт из каллуса женьшеня обусловливает большую работоспособность, а значит, меньшую утомляемость животных. Дополнительные исследования показали, что стимулирующий эффект от женьшеня «ин витро» не только не уступает, но даже превосходит природный корень. «Клетки женьшеня в культуре, — сделала общий вывод Р. Г. Бутенко, — содержат совсем не меньше гликозидов с высокой физиологической активностью, чем ткань знаменитого корня жизни».
Другой своей ученице с дальнего востока,  Н. Ф. Писецкой Р. Г. Бутенко поручила разобраться с физиологическими тонкостями роста культуры и попытаться подобрать наилучшую питательную среду. Чего в ней должно быть больше, что еще полезно добавить? Витаминов, минеральных солей, углеводов? Было испытано одиннадцать питательных сред с комбинациями двенадцати компонентов. Результаты поисков привели Н. Ф. Писецкую к сдержанным, но высокоинформативным выводам: «Обязательным для роста женьшеня в изолированной культуре тканей является внесение в питательную среду стимуляторов и витаминов. Концентрация агара 0,7 процента — наилучшая для роста ткани женьшеня. Повышение концентрации до одного процента снижает интенсивность роста. Получена питательная среда, в которой женьшень растет в шесть раз быстрее по сравнению со стандартной средой».
Вот что значит нестандартный подход к проблеме! Бутенко, ознакомившись с результатами работы своей настойчивой ученицы, бросила как бы между прочим:
— Не думаю, что все ясно с концентрацией агара в среде...
Испытующе посмотрев на Писецкую, шеф развила мысль:
— Большая плотность среды ограничивает площадь питания каллуса, сдерживает его рост. Не попробовать ли получить суспензионную культуру? Правда, жидкая среда будет затруднять дыхание клеток, но из этого можно найти выход. Попытайтесь получить суспензию! Там посмотрим...
Предвидение оправдалось. Клетки женьшеня отлично растут в жидкой питательной среде, как бы купаясь в ней. Они образуют не сплошную массу, а группы по две-три и больше пятидесяти клеток. Долго пришлось повозиться с определением размеров и веса посадочного материала. Сколько брать каллуса для запуска культуры? Сто, двести, пятьдесят миллиграммов? Оказалось, чем меньше возьмешь, тем больше получишь.
Впрочем, процесс выращивания клеток потребовал дополнительного условия. Как и предполагала Раиса Георгиевна, в неподвижных колбах и пробирках нижние слои клеток, погруженные в питательную жидкость, быстро начинали задыхаться от недостатка атмосферного кислорода. Как сделать так, чтобы все клетки, все комочки ткани соприкасались с воздухом? Вначале попытались использовать устройства, называемые за границей «шейкерами», а у нас — «трясунами». Помещенные на «шейкер» пробирки или колбы с культурой женьшеня при включении электромотора начинали судорожно дрожать, встряхиваться. Аэрация клеток, бесспорно, улучшалась, но достоинство системы быстро переходило в недостаток: «шейкер» входил в раж, клетки сталкивались друг с другом, травмировались и погибали. Тогда решили использовать аппараты роллерного типа: вертикальное колесо с гнездами для жесткого крепления сосудов с культурой равномерно вращается со скоростью три оборота в минуту. По закону силы тяжести содержимое сосудов мягко и плавно перекатывается с «бока на бок», с «ног на голову». Клетки и скопления их, погруженные в жидкую среду, периодически получают возможность «хлебнуть воздуху». Специалисты дали очень удачное название этому устройству — «колесо жизни».
Ныне открылись прямо-таки фантастические возможности не только для культивирования но и для селекции женьшеня на основе генной инженерии. Об-разцы наиболее продуктивных линий, или «сортов», тканей растения можно сохранить и поддерживать в лабораториях неопределенно долго. В наше время рекордсменом по длительности сохранения изолированных тканей является культура из корней моркови, полученная профессором Г. Готре в 1938 году. Вот уже сорок лет она живет и здравствует во многих лабораториях мира без каких-либо заметных признаков старения и ухудшения роста. Культуры клеток и тканей могут удерживаться не только путем бесконечных пассажей. Разработан, пожалуй, более перспективный и экономичный метод — создание «банков» клеток путем их глубокого замораживания и сохранения при температуре жидкого азота — минус 196 градусов. По мере надобности или по мере «востребования» нужный клеточный «вклад» изымают из «банка» и осторожно оттаивают, клетки вновь возвращаются к активной жизни.
Наука не чужда поэзии. Остроумные по замыслу, изящные по исполнению научные исследования нередко называют красивыми. Такой эпитет напрашивается при знакомстве с исследованием другой ученицы Раисы Георгиевны, ассистента кафедры физиологии растений Хабаровского педагогического института Галины Сергеевны Бычковой. Тема работы казалась сугубо теоретической и сухой — «Физиологические особенности размножения клеток в суспензионной культуре женьшеня». Изучались закономерности процесса деления или размножения клеток, изолированных из корня женьшеня. Он, этот процесс, протекал хаотично, казался неуправляемым. Одновременно размножалось не более двух процентов клеток. С помощью особых веществ Галине Сергеевне удалось вовлечь в упорядоченный процесс деления 6—8 процентов клеток, то есть в четыре раза больше. Очень важную информацию сумела получить исследователь после тонкого анализа изменения теплового баланса клеток в зависимости от их биологического состояния. Бычкова научно обосновала принципиальную возможность определения состояния культур в промышленных установках с помощью аппаратов — калориметров. Не наблюдая непосредственно за клетками, можно точно знать их состояние, определить, чем они «заняты». Результаты' этих работ были доложены на XII Международном ботаническом конгрессе и на
III Международном конгрессе по культуре клеток растительных тканей в 1975 году. Годом раньше Р. Г. Бутенко, лидер отечественной школы нового физиологического направления, была избрана в члены- корреспонденты Академии наук СССР по отделению биохимии, биофизики и химии физиологически активных соединений.
В 1977 году студент Хабаровского педагогического института А. Волков отлично защитил дипломную работу «Введение в культуру изолированной ткани аралии маньчжурской». Александру удалось впервые получить и культивировать каллус из молодых листьев лекарственной аралии, близкой родственницы женьшеня. Студенты — члены кружка физиологов растений под руководством кандидата биологических наук Г, С. Бычковой в 1978 году вырастили «ин витро» ткань другого заменителя женьшеня — элеутерококка.
В декабре 1976 года газета «Правда» опубликовала репортаж своего специального корреспондента Е. Дворникова. Заголовок мгновенно привлек внимание — «Женьшень растет на заводе». В городе Ефремове, чю и Тульской области, пущены установки по промышленному производству культуры тканей легендарного корня. Руководитель микробиологического сектора центральной лаборатории завода О. А. Гаврилова продемонстрировала корреспонденту небольшой флакон с мутноватой жидкостью. На поверхности плавали маленькие светло-желтые комочки клеток женьшеня. Масштабы произвели впечатление, так же как еще непривычная для понятия «завод» чистота в цехах, белоснежные халаты на рабочих, сосредоточенная тишина, нарушаемая легким жужжанием бактерицидных ламп. В цехе готовой продукции лежала партия женьшеня, упакованная в целлофановые мешки. Внешне он напоминал кукурузные хлопья. Хотелось говорить шепотом.
Наступил новый этап в тысячелетней истории знаменитого дальневосточного растения-реликта. Началась вторая жншь «царя лесных растений», долгая жизнь «ин витро».
.
.
Меню